FISH技術：熒光標記的原位雜交技術

　　1974年Evans將染色體顯帶技術和染色體原位雜交聯(lián)合應用，提高了定位的準確性。20世紀70年代后期人們開始探討熒光標記的原位雜交，即FISH技術。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標本上，標志著染色體定位技術取得了重要進展。20世紀90年代，隨著人類基因組計劃的進行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術得到了迅速的發(fā)展和廣泛應用。

　　1．原理

　　將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

  

肺腫瘤細胞FISH

　　2．實驗流程

　　FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結果分析。

　　3．特點

　　原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優(yōu)勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩(wěn)定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點:1、熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內使用；3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。

　　缺點：不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。

　　4．應用

　　該技術不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優(yōu)勢。

根生實驗流程

一、探針及標本的變性
（1）探針變性：將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

（2）標本變性：

①將制備好的染色體玻片標本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片標本，將其浸在70～75℃的體積分數(shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。
③立即按順序將標本經(jīng)體積分數(shù)70%、體積分數(shù)90%和體積分數(shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
二、雜交:
將已變性或預退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進行。
三、洗脫：此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低本底。
（1）雜交次日，將標本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
（2）將已雜交的玻片標本放置于已預熱42～50℃的體積分數(shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。
（3）在已預熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。
（4）在室溫下，將玻片標本2×SSC中輕洗一下。
四、雜交信號的放大:
（1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。
（2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。
（3）取出標本，將其放入已預熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。
（4）在玻片標本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。
（5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。
（6）取出標本，將其放入已預熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。
（7）重復步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。
五、封片:
    可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持數(shù)月之久。
六、熒光顯微鏡觀察FISH結果:
先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標記的探針的探針所在位置發(fā)出綠色熒光。由于本實驗使用的是Y染色體上的特異序列，因此在男性外周血染色體標本的雜交中呈陽性，即使在末分裂的細胞中，也可以觀察到明顯的雜交信號。照相記錄實驗結果